De PAM-fluorometer Inleiding Fotosysteem II Het licht van de PAM Meten met de PAM De yield Epiloog Vragen bij de tekst Docentenhandleiding Download the English summary Inleiding Zoals je weet hebben alle planten en algen een systeem waarmee ze licht in chemische energie kunnen vastleggen (fotosynthese). De werking van dit systeem hangt samen met de gezondheid van de cel. Of deze cellen gezond zijn bepaald vervolgens hoe snel een boom groeit, hoe groot de aardappelen van de boer worden en hoe goed er bijvoorbeeld in algenindustrie mest in algenbiomassa kan worden omgezet. Het is dus van groot belang te weten hoe gezond de cellen van een plant zijn. Hoe herken je nu een ongezonde cel? Een ongezonde cel zal een minder efficiënt systeem hebben. De efficiëntie van dit systeem is dus een maat voor de gezondheid van de cel. Hoe kun je deze nu op een eenvoudige manier meten? De fotosynthese bestaat uit verschillende groepen van reacties. Er zijn tal van technieken die kunnen meten hoe efficiënt een deel van deze reacties van de fotosynthese bij cellen verloopt. Een van de meest makkelijk toepasbare technieken hiervoor is de PAM-fluorometer (pulse amplified modulation fluorometer) meting. Met de PAM fluorometer kan je, door de te onderzoeken cel één lichtflits te geven, meteen zien hoe het er met deze cel voorstaat. De PAM meet op indirecte manier de efficiëntie van de doorgave van elektronen tijdens het fotosynthese proces. Om te weten hoe dit precies kan is het belangrijk eerst goed te begrijpen hoe de elektronenoverdracht geregeld is.   Met de PAM kun je meten dat de iep in het midden niet gezond is. terug Fotosysteem II Fotosysteem II (PSII) is een reactiecentrum waar elektronen, door energie uit licht, in een 'aangeslagen' toestand kunnen raken. Deze 'aangeslagen' elektronen bevatten nu een bepaalde hoeveelheid energie. Deze energie kunnen ze vervolgens, via andere elektronen, doorgeven aan het volgende reactiecentrum: fotosysteem I (PSI). Fotosysteem II geeft, onder invloed van licht, elektronen door aan fotosysteem I. In een cel wordt doorgaans maar een gedeelte gebruikt van alle aanwezige PSII's. De cel regelt, afhankelijk van de hoeveelheid licht waarin de cel groeit, hoeveel er 'open' en hoeveel er 'dicht' staan. Cellen die een tijdje in het donker hebben gestaan, zullen ervoor zorgen dat al hun fotosystemen open zijn, zodat ze al het nog aanwezige licht kunnen opvangen. Cellen die in de volle zon staan zullen juist zoveel mogelijk reactiecentra sluiten zodat ze niet te veel energie te gelijk opnemen. In een cel die aan een bepaalde hoeveelheid licht gewend is zal een deel van de PSII's open staan en een deel dicht. De hoeveelheid licht bepaald hoeveel reactiecentra er open zijn. Lichtenergie kan op drie manieren worden omgezet: in chemische energie, in warmte en in fluorescentie. Chemische energie ligt vast in alle verbindingen die gedurende de fotosynthese gevormd worden (van CO2 tot glucose). Warmte wordt eigenlijk bij bijna elk proces dat 'een tijdje' (milliseconden) loopt, gevormd. Fluorescentie treedt alleen op als elektronen terugvallen in de grondtoestand. Dit laatste proces vindt binnen korte (nanoseconden) tijd plaats. De aangeslagen elektronen uit PSII kunnen op verschillende manieren hun extra energie aan de omgeving kwijt: ze kunnen zoals boven beschreven hun elektronen overdragen richting PSI (route van de chemische energie). Ze kunnen ook een deel van hun energie kwijt in de vorm van warmte. Een laatste manier om lichtenergie kwijt te raken is door het weer in de vorm van licht (van een hogere golflengte) uit te zenden. Dit laatste proces heet fluorescentie. Een cel waarvan alle reactiecentra open staan zal invallend licht vooral vastleggen in chemische verbindingen. Hierdoor blijft er een minimale hoeveelheid energie over voor fluorescentie. Een cel waarvan alle reactiecentra gesloten zijn zal de lichtenergie niet kunnen omzetten in chemische energie en vooral over gaan op fluorescentie. De PAM meet deze fluorescentie. terug Het licht van de PAM Drie soorten licht De PAM kent drie soorten licht: het meetlicht, een verzadigende puls van licht en het actinische oftewel achtergrond licht. Het meetlicht (ML) is zo zwak dat het niet in staat is om een elektronenstroom op gang te brengen. Het meetlicht wordt in hele kleine pulsjes gegeven. Deze pulsjes zijn net sterk genoeg om het chlorofyl zoveel energie te geven dat er minimale fluorescentie optreedt. Er vindt geen warmtevorming plaats en ook wordt er geen energie vastgelegd in chemische verbindingen (geen fotosynthese). De verzadigende lichtpuls (SP) is bedoeld om in één klap (binnen 600 microseconden) alle PSII's te voorzien van lichtenergie. Het resultaat is dat alle PSII's gesloten worden. Het achtergrond licht (AL) dient ervoor om algen in hun natuurlijk lichtklimaat te houden. De sterkte van het licht hangt af van de omstandigheden waaronder de algen gekweekt zijn. Het AL brandt constant en heeft wel invloed op een aantal meetwaarden van de PAM (zie hieronder). De lichtdetector Een monster wordt dus met verschillende soorten licht beschenen. Samen met het fluorescentielicht gaat al dit licht richting de lichtdetector. Na het passeren van een aantal filters bereikt al het licht met een golflengte van ongeveer die van het fluorescentie licht de detector. Toch wil je uiteindelijk alleen het fluorescentie licht meten. Hoe kan dit? Dit is de grote 'truc' van de PAM: het meetlicht wordt gepulseerd gegeven! Hierdoor treedt de fluorescentie ook gepulseerd op (deze reageert immers onmiddellijk op het meetlicht). De detector versterkt alleen dit gepulseerde licht. De rest van het licht wordt niet versterkt en zal op de meting dan ook nauwelijks effect hebben. De Mini-PAM, een draagbare uitvoering van de PAM. terug Meten met de PAM Met de PAM heb je de mogelijkheid om op een aantal verschillende momenten de fluorescentie te bepalen. Door de cellen die je wilt meten een half uurtje in het donker te zetten zullen alle reactiecentra open gaan. De fluorescentie die je nu meet is de minimale fluorescentie (F0). Door nu een hele sterke lichtpuls te geven (verzadigende lichtpuls) zullen alle fotosystemen sluiten en vervolgens maximaal gaan fluoresceren (Fm). Door de cellen een half uurtje bij een bepaalde licht intensiteit te houden zal een deel van de fotosystemen dicht gaan, om overbelichting (foto-inhibitie) te voorkomen. De fluorescentiewaarde die je nu meet (F) is iets hoger dan de minimale fluorescentie (F0). Als je de cellen nu belicht met een extra hoge lichtpuls dan meet je een fluorescentie (F'm) die net iets lager is dan de Fm (zie de afbeelding hierboven). Hoe komt het dat deze waarde lager is, ondanks dat ook nu alle reactiecentra gesloten zijn? In het licht vindt er continu warmtevorming plaats. Warmtevorming is een trager proces dan fluorescentie en heeft dus op een meting met een enkele puls geen invloed. Als de cellen echter al een half uur in het licht staan is dit proces al op gang. Een deel van de lichtenergie zal dan niet naar fluorescentie gaan maar naar warmteproductie. Dat deze 'maximale' fluorescentie in licht iets lager is dan die in het donker komt doordat er nu ook sprake is van een continue warmtevorming. In deze afbeelding is de gemeten fluorescentie uitgezet tegen de tijd. Eerst krijgen de cellen de tijd om te wennen aan volkomen duisternis. Zelfs het meetlicht staat uit. Zonder licht is er natuurlijk geen fluorescentie. Als nu het meetlicht (ML) wordt aangezet (1) meet je een minimale fluorescentie: de F0. Dit is de fluorescentie van het chlorofyl. In de aan donker gewende cellen staan alle PSII's open. Als er nu een verzadigende lichtpuls wordt toegediend (2) zullen alle reactiecentra elektronen opnemen en vervolgens sluiten. Het resultaat is dat er nu een maximale fluorescentie kan plaatsvinden: Fm. Na een korte tijd is deze energiestoot verwerkt en komen de cellen weer terug in hun oude toestand. Nu wordt het actinische licht aangezet waardoor een gedeelte van de PSII's sluit. Het gevolg hiervan is dat er meer fluorescentie optreedt. Na een tijdje zijn alle pigmenten opnieuw gerangschikt en wordt het fluorescentiesignaal weer stabiel (3). Deze waarde is een soort afgeleide van F0 en heet F. Ook nu kan er weer een verzadigende lichtpuls worden toegediend (4). Dit heeft weer als resultaat dat alle open PSII's een elektron opnemen en dus een maximaal fluorescentie signaal zullen afgeven. Deze fluorescentiewaarde is een soort afgeleide van Fm en heet F'm. Omdat nu ook een deel van de energie omgezet wordt in warmte zal F'm iets lager liggen dan de echte Fm. terug Elke cel heeft zijn eigen concentratie chlorofyl en PSII. Niet bij elke proef zul je met dezelfde concentratie cellen meten. Door deze variabelen meet je per proef vaak sterk uiteenlopende fluorescentiewaarden. Als je immers een hogere chlorofylconcentratie hebt zal er ook een sterkere fluorescentie optreden. Voor een betrouwbare interpretatie van deze waarden is het echter wel belangrijk dat ze tussen een bepaald minimum en maximum in liggen. Om hiervoor te zorgen kun je een aantal onderdelen van de PAM afstellen. Ten eerste kun je het actinische licht aanpassen aan de lichtcondities waarin de te meten cellen zijn gekweekt. Dit heeft nog niet veel effect op het signaal van de PAM. Vervolgens kun je het meetlicht ook afstellen. Des te sterker dit meetlicht, des te sterker wordt het eindsignaal. Je moet er dan wel rekening mee houden dat een sterk meetlicht ook een hogere basis lichtsterkte betekent. Met de functie 'damping' kun je regelen hoe lang de verzadigende puls duurt. Hierbij geldt hoe langer de duur van de puls des te meer signaal je zult meten. Het is belangrijk om op te letten dat de puls volgens een 'nette' piek blijft verlopen. Tot slot kan met de 'gain' afgesteld worden hoe sterk het signaal door de detector versterkt wordt. Bij een erg hoge gainwaarde kan het wel gebeuren dat je extra veel verstoring meet. De yield Met de F0 en Fm kan een yield berekend worden. Een yield is een maat voor de efficiëntie waarmee de elektronen worden doorgegeven. Als de cel de energie van de elektronen nuttig gebruikt is zijn yield hoog. De yield kan direct worden berekend met de echte F0 en Fm volgend de formule: yield in donker = (Fm - F0) / Fm Het grote voordeel van het meten met aan het donker aangepaste cellen is dat je hiermee kunt schatten hoeveel chlorofyl de cel bevat. Want hoe meer chlorofyl de cel bevat des te meer fluorescentie zal er worden gemeten. Met andere worden hoe meer chlorofyl per cel des te hoger is de F0 waarde die je zult meten. De yield kan echter ook worden bepaald met de afgeleiden: F en F'm. De formule luidt dan: yield in licht = (F'm - F0) / F'm. Het voordeel van deze laatste maat is dat hij beter de natuurlijke yield weergeeft dan de yield die in het donker is gemeten: cellen groeien immers nooit in het donker. Elke cel heeft zijn eigen concentratie chlorofyl. Van boven naar beneden: diatomee (alg), gewoon appelmos, zachte naaldvaren en een blad van een zomereik. terug Epiloog In de biologie neemt de fotosynthese al van oudsher een belangrijke plaats in. Meten met radioactieve zuurstof isotopen leverde informatie over hoe goed een cel presteert. Dit soort proeven kan echter alleen maar gedaan worden in goed beveiligde laboratoria. Zoals je nu hebt kunnen lezen is de PAM veel eenvoudiger om te gebruiken. In een korte tijd kun je er een hoop gegevens mee verkrijgen. Wie weet kom je er ooit nog wel eens mee in aanraking.   Het wordt steeds eenvoudiger om wat van planten te weten te komen. (Uit Suske en Wiske:'De Klankentapper') terug   Vragen bij de tekst Wat is het verschil tussen F0 en F? Leg uit welke waarde hoger zal zijn. erew Met een PAM-fluorometer zijn de volgende fluorescentie waarden gemeten: F0 1100, Fm 3000, F 1200 en F'm 2800. A Bereken de yield in het licht en in het donker. B Leg uit hoe het komt dat de yield in het licht iets lager is. C Wat zegt dit over de invloed van licht op de gezondheid van de alg? erew Wat is er zo ' handig ' aan de lichtdetector van de PAM? jhhgj Met drie verschillende potjes algen wordt een proefje gedaan. Alle drie de potjes worden veertig minuten in het donker gezet. Een potje bevat algen soort A, eentje algen soort B en eentje algensoort B in een twee keer zo hoge concentratie. A Heeft de concentratie van deze algen een invloed op de yield die de PAM meet? Leg je antwoord uit. Soort A blijkt een lagere F0 te hebben dan soort B. B Wat zegt dit over soort A? C Zal de F0 van het potje met soort B met de twee maal zo hoge concentratie hoger of lager zijn dan die van soort B met normale concentratie? Leg je antwoord uit. fghf Stel dat er bij een bepaalde cel relatief weinig licht wordt gebruikt voor chemische energie (maar bijvoorbeeld voor warmte) meet je met de PAM dan een hoge of juist een lage yield. Leg je antwoord uit. ghf Uit een homogene algensuspensie worden twee gelijke monsters gehaald. Het ene monster wordt onder een lamp gehouden. In dit licht worden de bijbehorende lage en hoge fluorescentie waarde bepaald. A Wat zijn de symbolen voor de lage en hoge fluorescentie waarden die op deze manier worden bepaald? Met het andere monster wordt precies dezelfde meting gedaan, alleen nu wordt een twee keer zo sterke lamp gebruikt. B Zijn de waarden die je meet hoger of lager dan die bij A? C Leg uit hoe dit komt. ghf Bij bijna alle chemische processen treedt warmtevorming op. Ook bij fotosynthese. Hoe komt het dat dit energieverlies niet (noemenswaardig) bijdraagt aan de verlaging van je fluorescentiesignaal gemeten in het donker? ghf Aan een algensuspensie wordt een stofje toegevoegd dat een groot deel van de elektronen die van PSII afkomen wegvangt. Wat gebeurt hierdoor met de yield die je van deze algensuspensie zou kunnen meten? ghf Bedenk een onderzoek waarbij de PAM-fluorometer goed van pas zou kunnen komen. ghf De laatste jaren wordt er veel gepraat over verzuring van de bossen. Doordat er veel 'zure ' regen valt, produceren de bomen minder of slechter bladgroen. Leg uit op welke manier je met de PAM kunt nagaan of dit klopt. terug Docentenhandleiding Korte inleiding bij het gebruik van de tekst De PAM-fluorometer is een apparaat dat op het gebied van onderzoek naar alle fotosynthetiserende cellen (zowel planten als algen) een steeds belangrijkere rol begint in te nemen. Het apparaat komt in steeds meer diverse vormen voor; zowel qua omvang als qua gevoeligheid en kwetsbaarheid. Gezien de eenvoudige toepassing en de steeds handzamere uitvoeringen (nu al ter grote van een stevige lunchtrommel) is het zeker niet ondenkbaar dat dit apparaat in de toekomst ook ter beschikking van het voortgezet onderwijs komt. De theorie van de PAM sluit goed aan op de lessen over fotosynthese. Deze tekst is bedoeld om een indruk te geven hoe de PAM grofweg werkt en welke informatie dit apparaat levert. Meer specifieke gegevens wisselen per uitvoering van het apparaat. Deze zullen dan ook uit een handleiding gehaald moeten worden. De tekst is ingedeeld in een basistekst die alle begrippen rondom de PAM uitlegt. Daarnaast is hij uitgebreid met een aantal tekstboxen die sommige begrippen wat verder uitleggen. Er wordt vanuit gegaan dat de leerlingen al enige idee hebben van het functioneren van een planten cel: begrippen als chlorofyl en fotosynthese worden bekend verondersteld. Meer gedetailleerde begrippen als fotosysteem I en II worden beknopt uitgelegd. Dergelijke begrippen worden echter als bijzaak beschouwd: het verdient dan ook aanbeveling om in andere lessen hier dieper op in te gaan. De stof is vrij pittig en verseist daarom als ingangsniveau minimaal 4 VWO. Antwoorden op de vragen F0 wordt gemeten in het donker aan cellen die gewend zijn aan het donker. Vrijwel alle reactiecentra zullen open staan. Er zal een minimale fluorescentie waarde worden gemeten. F wordt gemeten in het licht aan cellen die kort daarvoor nog in het licht waren. Hierdoor sluit een aantal reactiecentra. Het gaat niet om een verzadigende lichtpuls dus maar een relatief klein deel van de reactie centra zal dicht zijn. Toch resulteert dit kleine verschil erin dat de F fluorescentie waarde net iets hoger is dan de F0 fluorescentie waarde. ghf A yield in licht = 2800 - 1200 / 2800 = 0.57 yield in donker = 3000 - 1100 / 3000 = 0.63 B Omdat het verschil tussen de lage en de hoge fluorescentiewaarden in licht kleiner is dan het verschil tussen de waarden gemeten in het donker. C Blijkbaar is licht tevens een beperking voor de efficiëntie van de elektronenoverdracht. Hoe meer licht des te minder efficiënt werkt de overdracht. Te veel licht is voor een cel dan ook ongezond. ghf De lichtdetector versterkt alleen gepulseerd licht. Alleen het fluorescentie signaal pulseert. Dus alleen dit signaal (en niet het achtergrondlicht) wordt versterkt. A Nee. De yield is een eigenschap die wat zegt over de gezondheid van je cel. Deze is niet afhankelijk van de concentratie van de cellen. B Soort A bevat minder chlorofyl dan soort B. C Deze zal hoger zijn. De fluorescentie wordt hoger naarmate er een hogere concentratie cellen (en dus een hogere concentratie chlorofyl) aanwezig is. ghf Van de totale hoeveelheid lichtenergie gaat een deel verloren aan warmteproductie. Deze energie kan niet meer gebruikt worden als chemische energie. De cel haalt op deze manier minder chemische energie uit dezelfde hoeveelheid lichtenergie. Dit betekent dat de cel minder efficiënt werkt. De PAM zal dus een lagere yield meten. ghf A F en F'm. B De F is hoger. De F'm is lager. C Een twee keer zo hoge lichtsterkte zorgt er voor dat de algen meer reactiecentra zullen sluiten om overbelichting te voorkomen. De energie van het licht dat valt op een gesloten reactiecentrum zal niet meer gebruikt kunnen worden voor chemische energie. Deze lichtenergie zal daarom deels in warmte en deels in fluorescentie omgezet worden. De (extra) fluorescentie-energie levert een hogere F waarde op. In het licht vindt er continu warmtevorming plaats. Warmtevorming is een trager proces dan fluorescentie en heeft dus op een meting met een enkele lichtpuls geen invloed. Als de cellen echter al een half uur in het licht staan is het warmtevormingsproces al op gang. Een deel van de lichtenergie zal dan niet naar fluorescentie gaan maar naar warmteproductie. Als het achtergrondlicht tijdens de meting sterker is zal er meer energie gaan naar warmteproductie en dus minder naar fluorescentie: de F'm-waarde is dan lager. ghf Zoals bij 6c al is uitgelegd is het proces van warmtevorming een veel trager (milliseconden) proces dan fluorescentie (nanoseconden). In eerste instantie wordt dus alle energie gebruikt voor fluorescentie. Pas later, na de meting van de PAM, gaat een deel van de lichtenergie naar warmtevorming en zal de fluorescentie afnemen. ghf Doordat een deel van de elektronen wordt weggevangen zal de overdracht van elektronen minder efficiënt verlopen dan voor de toevoeging van de stof. Het resultaat is dus een minder efficiënte elektronenoverdracht oftewel: een lager yield. ghf Elk onderzoek naar het functioneren van organismen met chlorofyl (PSII). ghf Door de yield in de bladeren van een 'verzuurde' en een niet 'verzuurde' boom te bepalen. De gezonde boom heeft, als het goed is, een hoger yield.