Groen fluorescerend eiwit labelt eiwitten in levende cellen:

Tipje van de sluier van eiwitlocalisatie en -transport in de cel

Door Evie Goossen

 

Leestip: Lees eerst de vragen voor je met de tekst begint.

 

Eiwitten zijn van essentieel belang voor leven. Zonder eiwitten zou geen DNA-replicatie plaatsvinden. Ze vervullen allerlei belangrijke functies in ons lichaam, sommige zijn bouwstoffen, andere signaalstoffen, afweerstoffen of enzymen. Voor een gezond lichaam moeten de juiste eiwitten geproduceerd worden. Elk eiwit heeft een specifieke vouwing, waarin hij actief is. Bij onjuiste vouwing ontstaan defecten doordat bijvoorbeeld het actieve centrum geblokkeerd wordt. Het eiwit werkt niet meer of juist verkeerd.

Maar met het produceren van eiwitten in de goede vorm is een organisme er nog niet. Iemand kan wel topfitte verteringsenzymen produceren, maar als dit in zijn grote teen plaatsvindt dan heeft hij er nog niets aan. Een goede localisatie is net zo belangrijk als een goede productie. Ook binnen cellen is localisatie van eiwitten geregeld. Aangezien de meeste eiwitten in de cel in het cytoplasma geproduceerd worden, moeten deze eiwitten naar de goede organellen getransporteerd worden.

Deze tekst gaat in op de localisatie en het transport van eiwitten binnen cellen. Hierna wordt gekeken naar een moderne techniek waarmee eiwitten in levende cellen zichtbaar gemaakt kunnen worden met groene fluorescerende eiwitten.

 

Eiwitlocalisatie en -transport

Na eiwitsynthese in het cytoplasma, worden eiwitten met een sorteringssignaal naar andere organellen getransporteerd. Ontbreekt dit signaal, dan blijven ze in het cytoplasma. Er zijn verschillende sorteringssignalen voor de kern, mitochondrieën, chloroplasten, peroxisomen en het endoplasmatisch reticulum (ER). Via eiwitten in de membranen van deze organellen worden de nieuw aangevoerde eiwitten de cel in getransporteerd.

Voor een groot deel van de organellen bestaat geen sorteringssignaal. Deze organellen krijgen hun eiwitten niet direct vanuit het cytoplasma, maar via blaasjes vanaf het ER. Zoals in figuur 1 schematisch is weer gegeven kunnen eiwitten die in het ER belanden verder getransporteerd worden naar andere organellen. Van het ER worden blaasjes met daarin het eiwit afgesnoerd, deze smelten vervolgens samen met het Golgi-apparaat. Van het Golgi-apparaat kunnen ook weer blaasjes afgesnoerd worden naar bijvoorbeeld lysosomen, tot de eiwitten in het juiste organel zijn aanbeland.

Omdat veel eiwitten via het ER worden getransporteerd, worden eiwitten niet alleen vrij in het cytoplasma gesynthetiseerd door losse ribosomen, maar zitten er ook ribosomen op het ER zodat de gesynthetiseerde eiwitten direct het ER in getransporteerd worden.

Figuur 1: Eiwittransport in de cel. De groene stipjes stellen eiwitten voor. Met behulp van blaasjes worden eiwitten van het endoplasmatisch reticulum naar het Golgi en vervolgens naar andere organellen getransporteerd.

 

Eiwitten volgen in de cel met Groen Fluorescerend Eiwit

Onder andere door genoom-projecten, zoals het Humane Genoom Project raken steeds meer eiwitten bekend. Op basis van DNAsequenties wordt bekeken welke eiwitten theoretisch gevormd kunnen worden. Een groot deel van het onderzoek begint nu pas. Nu moet gekeken worden wanneer een eiwit tot expressie komt, waar in de cel, welke functie het eiwit heeft en wat de dynamiek van een eiwit is. Deze gegevens zijn belangrijk om te begrijpen welke rol een eiwit speelt, en om bij defecten (ziekten) medicijnen te ontwikkelen.

Graag zou je een kijkje nemen in levende cellen om te zien wat gebeurt. Sinds een aantal jaar is het onderzoekers gelukt om eiwitten te labellen, zodat ze eiwitten in cellen kunnen volgen. Aan het eiwit dat onderzocht wordt, zit een groen fluorescerend eiwit, Green Fluorescent Protein (GFP), gekoppeld. Om deze combinatie-eiwitten (fusie-eiwitten) te krijgen wordt gebruik gemaakt van genetische transformatietechnieken. DNA van het te onderzoeken eiwit wordt gekoppeld aan DNA dat codeert voor GFP. Vervolgens wordt dit DNA weer terug in de cellen gebracht. Zodra het gen tot expressie komt, worden eiwitten geproduceerd waaraan GFP vast zit. Je kunt volgen wanneer het eiwit gesynthetiseerd wordt en waar. Ook aan de mate van fluorescentie kun je zien hoeveel eiwit geproduceerd wordt. Na eiwitsynthese kan ook het transport in de cellen gevolgd worden.

 

Waar komt GFP vandaan?

GFP is een klein eiwit dat oorspronkelijk uit kwallen komt. De kwal Aequoria victoria geeft groen licht, afkomstig van GFP (zie figuur 2). Het licht van de kwal wordt eigenlijk door twee eiwitten geproduceerd. Energie van een chemische reactie wordt door het eiwit auqorin omgezet in een blauwe gloed. De energie die hierbij vrijkomt, wordt gebruikt door GFP, dat groen licht uitzendt.

Figuur 2: kwallen, Aequoria victoria.

 

Wat is GFP voor eiwit?

GFP is een tamelijk klein eiwit met een bijzondere struktuur. Het deel dat licht geeft, de fluorofoor, wordt beschermd door de rest van het eiwit, dat een soort kooi vormt om de fluorofoor. De kooi maakt de fluorofoor minder kwetsbaar. Door licht met een lage golflengte, bijvoorbeeld UV licht op de cellen te schijnen, kan GFP de energie hieruit omzetten in licht met een kortere golflengte, namelijk groen licht.

Een probleem dat elke fluorofoor heeft, is een beperkte levensduur. Na een bepaalde tijd, geeft het eiwit geen licht meer. Dit proces wordt fotobleking genoemd.

Figuur 3: Molecuul structuur van Green Fluorescent Protein (GFP). In het midden zitten de fluoroforen, de buitenkant van het eiwit molecuul heeft een soort kooi structuur.

 

Resultaat van GFP-fusie eiwitten

In de onderstaande figuur staan een aantal afbeeldingen van GFP-fusie eiwitten in plantencellen.

In de afbeelingen A en B is GFP niet aan eiwitten gekoppeld. Deze foto's zijn ter controle. In de volgende afbeeldingen is GFP gekoppeld aan eiwitten die in verschillende organellen gelocaliseerd zijn.

C is een GFP-fusie eiwit dat een plasma membraan kanaal vormt. Door plasmolyse, is op de foto is duidelijk te zien dat het eiwit niet in de celwand zit, maar in het plasmamembraan. Er zitten gaten tussen de membranen.

D laat een eiwit zien dan in de celmembraan zit. In de afbeelding zijn duidelijk de plaatsen te zien waar de cellen met elkaar in contact staan.

E laat een eiwit in het endoplasmatisch reticulum zien.

F is GFP gekoppeld aan een vacuolemembraan kanaal eiwit. Je kunt zien hoe groot vacuoles in plantencellen zijn. Ook zie je bredere membraan stukken, hier stulpt het membraan om andere organellen.

G laat eiwit bubbels zien. Het is nog onduidelijk in of op welk organel het eiwit zich bevindt.

H toont een eiwit dat in het cytoplasma blijft.

I laat celkernen zien. GFP is aan eiwit gefuseerd dat een rol speelt in de transcriptie van DNA.

Ook in J is GFP gefuseerd aan een eiwit dat in specifieke delen in de celkern zit.

Figuur 4: GFP-fusie eiwitten in plantencellen.

 

De localisatie van eiwitten is duidelijk te volgen door GFP-fusie. Door foto's te maken met tijdsintervallen kan ook de dynamiek van eiwitten gevolgd worden. Tijdens onderzoek bleek dat GFP experimenten regelmatig structuren opleverden die niet verwacht waren. Nieuwe structuren werden zichtbaar, zoals in afbeelding G. Naast de mogelijkheden om GFP te gebruiken om de functie en localisatie van eiwitten te achterhalen leidt het dus ook tot de ontdekking van nieuwe structuren in de cel.

 

Vragen

  1. Waarom denk je dat de cel niet alle eiwitten los in het cytoplasma synthetiseert, maar ook eiwitten direct het ER in synthetiseert?
  2. De kwallen Auquoria victoria geven uitzichzelf groen licht. Waarom moeten cellen met GFP-fusie-eiwitten met UV-licht beschenen worden om ze te laten fluoresceren?
  3. Waarom is GFP zo'n geschikt eiwit om mee te labellen? Waarom specifiek dit fluorescerende eiwit?
  4. Niet alle onderzoekers zijn overtuigd van het nut van onderzoek naar eiwitten met behulp van GFP. Ze zeggen dat het eiwit veranderd is waardoor je niet met zekerheid kunt zeggen of het oorspronkelijk eiwit zich op dezelfde manier gedraagt als het GFP-fusie eiwit. Leg uit welke problemen ontstaan zouden kunnen zijn door de fusie van het eiwit aan GFP.
  5. Is het mogelijk een eiwit gedurende lange tijd te volgen? Leg uit.

terug

Meer weten?

Wil je meer weten over GFP, bijvoorbeeld over hoe fluorescentie werkt, dan kun je kijken op http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff.

 

Woorden

Peroxisomen staan bekend als detoxificatie organellen. Het zijn blaasjes met enzymen, die met behulp van oxidatie (vandaar perOXIsomen) o.a. alcohol detoxificeren, het gevaarlijke waterstof-peroxide omzetten in water en zuurstof en vetzuren afbreken tot bruikbare bouwstenen. terug

Plasmolyse is de tegenhanger van turgor. Door watertekort in de cel komt de celmembraan los van de celwand. terug

 

Bronnen

Figuur 2 en 3 komen van http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff.

Figuur 4 komt uit PNAS, vol 97, maart 2002, p. 3718 -3723.